酵母菌和霉菌总数检测

酵母菌和霉菌总数检测

在食品、药品、化妆品、环境监测以及许多其他工业领域，微生物污染控制是确保产品质量和安全的核心环节。酵母菌和霉菌作为自然界中广泛存在的真菌类群，是导致产品腐败变质、产生不良风味甚至潜在毒素（如霉菌毒素）的重要微生物污染源。酵母菌和霉菌总数检测是评估产品卫生状况、生产过程卫生控制水平以及预测产品货架期的一项关键微生物学指标。准确测定样品中活的可培养的酵母菌和霉菌的数量，对于监控生产环境卫生、评估原材料质量、验证消毒灭菌效果以及最终产品的放行都具有极其重要的意义。该检测项目尤其对含水量较高、糖分含量丰富或储存条件不当的样品至关重要。

检测项目

酵母菌和霉菌总数检测的核心目标是定量测定在特定条件下，单位重量（如克）或单位体积（如毫升）的样品中所含有的活的可培养的酵母菌和霉菌的总数量。这里的“总数”指的是能够在选定的培养基上、在特定的培养条件下（温度、时间、需氧状态）生长并形成可见菌落（colony forming units, CFU）的酵母菌和霉菌的总和。值得注意的是：

• 该检测通常不区分酵母菌和霉菌的种类，而是报告其总和。

• 结果反映的是样品中处于可培养状态（即具有生长繁殖能力）的酵母菌和霉菌的数量。

• 该计数不包括那些处于休眠、受损（VBNC状态）或完全失去活力的细胞。

• 它主要用于卫生指示和腐败潜力评估，而非全面的菌群鉴定。

检测方法

目前最广泛采用且被标准化的检测方法仍然是平板计数法（倾注法或涂布法）。其基本原理是将样品或其稀释液接种到选择性培养基上，在适宜条件下培养，使活的酵母菌和霉菌细胞生长繁殖形成肉眼可见的菌落，然后进行计数。关键步骤包括：

1. 样品制备与稀释： 根据样品类型（固体、液体、半固体）进行均质化（如使用拍打式均质器）或振荡混匀。制备一系列10倍梯度稀释液（如10⁻¹, 10⁻², 10⁻³等），以得到可计数的菌落密度（理想范围是15-150 CFU/平板）。

2. 接种与培养：

   • 倾注法： 取一定体积（通常1mL）的样品匀液或稀释液加入无菌平皿中，倾注已融化并冷却至45-50℃的选择性琼脂培养基（如孟加拉红琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂PDA、或含抗生素的特定培养基），迅速混匀，凝固。

   • 涂布法/铺平板法： 在已凝固的琼脂平板表面，取0.1mL或0.2mL的样品匀液或稀释液，用无菌涂布棒均匀涂布于整个表面。

3. 培养条件： 将接种后的平板倒置，置于25-28℃的恒温培养箱中，进行需氧培养。培养时间通常为5-7天。霉菌生长相对较慢，需要较长时间才能形成典型菌落。培养期间可能需要每日观察菌落生长情况。

4. 菌落计数与报告： 培养结束后，选取具有15-150个菌落的平板进行计数。计数所有酵母菌菌落（通常较小、湿润、不透明、奶油色或白色，有时呈粉红色）和霉菌菌落（通常呈绒毛状、絮状或粉末状，颜色多样）。计算结果并报告为CFU/g（克）或CFU/mL（毫升）。

其他方法（常用于快速检测或特定需求）：

• 膜过滤法： 适用于检测液体样品中低浓度的酵母菌和霉菌。将一定体积的样品通过无菌滤膜过滤，将滤膜转移到选择性琼脂平板上进行培养计数。

• 快速检测系统： 包括基于显色培养基、酶底物反应、ATP生物发光、阻抗/电导法以及分子生物学方法（如PCR、qPCR）等的商品化试剂盒或仪器。这些方法通常比传统平板法更快（数小时至2天），但可能成本较高，且需要验证其等效性或准确性。

检测标准

酵母菌和霉菌总数的检测必须遵循公认的标准方法，以确保结果的可比性、准确性和可靠性。国际上和各国都制定了相应的标准：

• 国际标准 (ISO)：

  • ISO 21527-1:2008： Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds — Part 1: Colony count technique in products with water activity greater than 0.95. (食品和动物饲料微生物学 - 酵母菌和霉菌计数的水平方法 - 第1部分：水分活度大于0.95产品中的菌落计数技术)。

  • ISO 21527-2:2008： ... Part 2: Colony count technique in products with water activity less than or equal to 0.95. (... 第2部分：水分活度小于或等于0.95产品中的菌落计数技术)。

• 中国国家标准 (GB)：

  • GB 4789.15-2016： 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》。这是中国现行强制性国家标准，规定了食品中霉菌和酵母计数的检验方法（主要基于平板计数法）。该标准详细规定了培养基、样品处理、稀释、接种、培养、计数和结果报告的要求。

• 其他国家和地区标准： 如美国FDA的 Bacteriological Analytical Manual (BAM) 第18章 “Yeasts, Molds and Mycotoxins”，美国的AOAC Official Methods of Analysis (如AOAC 997.02)，欧洲药典 (EP)，美国药典 (USP) 等也包含了针对特定产品（如药品、化妆品）的酵母菌和霉菌计数方法。

选择培养基的重要性： 标准方法中明确规定了推荐使用的培养基（如PDA, 孟加拉红琼脂, 添加抗生素如氯霉素或庆大霉素的PDA等）。这些培养基：

• 能支持酵母菌和霉菌的生长。
• 含有抑制细菌生长的成分（如低pH、添加抗生素），减少细菌的干扰。
• 可能包含显色剂（如孟加拉红）或指示剂，有助于区分或观察菌落。

严格遵循相关检测标准中规定的样品处理、稀释度选择、培养基制备、培养条件和结果计算规则，是保证检测结果准确性和实验室间可比性的基石。